واکنش زنجیره پلی مراز(PCR)

واکنش زنجیره ای پلی مراز(PCR)

پیشرفت های دو دهه اخیر در زمینه بیولوژی ملکولی موجب ارتقا کارایی و تکامل هر چه بیشتر آزمایش های وابسته به DNA در علوم بالینی  گردیده است، یکی از مهم ترین پیشرفت ها در زمینه بیولوژی ملکولی که در عین حال کاربرد تشخیصی نیز دارد PCR (Polymerase Chain Rreaction ) می باشد که علاوه بر سریع نمودن آزمایش های وابسته به DNA در موارد متعدد موجب افزایش حساسیت این گونه آزمایشات گردیده است و به عنوان یک روش حساس، سریع و دقیق در آزمایشات بالینی و میکروبیولوژی مواد غذایی استفاده می شود.

تعریف PCR

PCR به روش ازدیاد مقادیر جزئی DNA یا RNA (ازدیادRNA با روش RT-PCR  امکان پذیر است) تا حد مشاهده آن ها توسط روش های ساده و رایج آزمایشگاهی اطلاق می شود. قابلیت PCR در ازدیاد اسیدهای نوکلئیک موجود در نمونه مورد آزمایش موجب شناسایی سریع و اختصاصی نوع سلول یا میکروارگانیسم مورد نظر در نمونه مذکور می گردد، این ویژگی علاوه بر به کارگیری PCR در تشخیص آزمایشگاهی بیماری ها و شناسایی انواع سلول ها ، آن را به عنوان ابزاری مطمئن و حساس در زمینه پژوهش های علمی مطرح می سازد و یکی از محوری ترین تکنیک های ملکولی و ژنتیک محسوب می شود.

کارایی PCR

در خصوص کارایی این روش در تشخیص به طور مثال می توان تقلیل مدت زمان تشخیص آزمایشگاهی باسیل سل  را از 7-6 هفته به 7-6 ساعت (حتی با وجود تعداد اندک باسیل در نمونه آزمایشگاهی)  ذکر کرد.با استفاده از این تکنیک  میکروارگانیسم هایی نظیر باسیل جذام و باسیل سل از نمونه های باستانی شناسایی و جدا گردیده است.

اساس واکنش زنجیره پلی مراز (PCR):

برای اینکه بتوان قطعه ای از یک توالی بلند DNA را در محیط آزمایشگاه تکثیر داد و از آن قطعه میلیون ها کپی ساخت ، باید فرایندی نظیر همانند سازی DNA در باکتری را تقلید نمود و آن را بارها در یک تیوب کوچک تکرار نمود، برای این واکنش به اجزای زیر نیاز است:

1) رشته DNA الگو : جهت تکثیر یک قطعه از DNA وجود DNA  الگو ضروری است معمولا بین 10 تا 100 کپی از رشته الگو نیاز است.
2) پرایمرها: از یک جفت الیگونوکلئوتید 18 تا 30نوکلوتیدی که در واقع آغازگر واکنش DNA پلی مراز  هستند و هر یک از آن ها مکمل بخشی از یکی از رشته های DNA الگو می باشد، با توجه به اینکه هر یک از آن ها مکمل یکی  از دو رشته الگو می باشد و واکنش DNA پلی مراز تنها در جهت ´3 →´5 انجام می شود، اتصال آن ها به رشته های الگو باعث می گردد که واکنش های DNAپلی مراز هر رشته در جهت پرایمر رشته دیگر هدایت می شوند.
3) DNA پلی مراز: آنزیم کاتالیز کننده ساخت زنجیره DND  می باشد.
4) دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP) : در یک واکنش PCR استاندارد، از مخلوطی از dNTP  ها که حاوی میزان مساوی از هر چهار نوع  dNTP (dTTP، dGTP، dCTP ،dATP  ) است، استفاده می شود. آنزیم DNA  Taq پلی مراز با توجه به DNA هدف در جهت ´3 →´5 واحدهای dNTP را به پرایمر می افزاید و رشته DNA  کپی را می سازد.
5) کاتیون دو ظرفیتی: DNA پلی مراز مقام به حرارت برای همانندسازی DNA به یون Mg²+ آزاد نیازمند است.
6) بافر حفظ کننده PH: معمولا یسیتم های بافری گوناگون با PH بین 8.3 تا 8.8 استفاده می شوند که حاوی یون های تک ظرفیتی نظیر KCL نیز می باشد.

مکانیسم واکنش زنجیره ای DNAپلی مراز

PCR از سه مرحله اساسی تشکیل می شود
1- تک رشته ای شدن رشته DNA الگو توسط حرارت (denaturation)
2- اتصال پلی مرهای نوکلئوتیدی به تک رشته DNAالگو (annealing)
3- گسترش پرایمر در جهت ´3 →´5 با استفاده از الگو DNA هدف (extension)

در هر واکنش PCR ابتدا دو رشته DNA در درجه حرارت ϲ̊95-94 طی مدت 30 تا 60 ثانیه از یکدیگر جدا می شوند، سپس درجه حرارت کاسته شده تا به درجه حرارتی که مناسب چسبیدن پرایمر به رشته الگو باشد  (annealing) برسد، این درجه حرارت معمولا 3 تا 5 درجه سانتی گراد پایین تر از دمای ذوب پرایمرها است. پس از چسبیدن پرایمر به الگو ، درجه حرارت به 72 درجه افزایش داده می شود به طوری که DNA پلی مراز بتواند رشته پرایمر را بسط دهد و طویل سازد، مدت زمان لازم برای این مرحله بستگی به طول قطعه مورد نظر دارد ( معمولا آنزیم Taq برای ساخت هر قطعه 1000بازی یک دقیقه زمان نیاز دارد . این سه مرحله به طور معمول 30تا 40 بار تکرار می شوند تا اینکه میلیاردها کپی از قطعه مورد نظر تکثیر شود ( تعداد کپی به میزانDNA  الگوی اولیه و کارایی واکنش PCR بستگی دارد).

روئیت قطعه تکثیر یافته : پس از اینکه قطعه DNA تکثیر داده شد، محصول PCR روی ژل آگار در حضور بافر مناسب الکتروفورز می گردد، برای این منظور پودر آگارز به محیط بافر اضافه شده و با حرارت حل می شود تا به شکل محلول شفاف تبدیل شود سپس این محلول روی سینی الکتروفورز ریخته  با سرد کردن محلول، فرم ژل ایجاد می شود  معمولا ماده ای به نام اتیدیوم بروماید به ژل اضافه می شود که با قرارر گرفتن در وسط دو رشته DNA آن را رنگ آمیزی می کند ، بعد از انجام الکتروفورز و حرکت DNA به سمت قطب مثبت ژل، ژل آگارز روی دستگاهی (ترانس ایلومیناتور) قرار می گیرد که نور UV   با طول موج 320 نانومتر ایجاد می کند DNA تکثیر یافته در طول ژل حرکت می کند و  و هنگامی که ژل در معرض UV قرار می گیرد با تابیدن نور UV به اتیدیوم بروماید قطعات DNA به شکل یک باند روشن به رنگ زرد مایل به صورتی دیده می شوند معمولا در کنار محصول PCR ،   یک مخلوط DNA با اندازه های مشخص (ladder) نیز الکتروفورز می شود تا با توجه به اندازه آن بتوان اندازه محصول PCR را محاسبه کرد .

وسایل و دستگاه های مورد نیاز :

ترمو سایکلر ،میکروتیوب،رک میکروتیوب، سمپلر متغییر، ترانس ایلومیناتور، الکتروفورز افقی، میکروفیوژ

کاربرد

1- تشخیص ملکولی بیماری ها
2- کلونینگ ژن، تعیین توالی ژن، تعیین بیان ژن، تغییر ژن و شناسایی ژن ها
3- تشخیص بیماری های ویروسی (کرونا )
4- تعیین اثر انگشت
5- تشخیص انواع سرطان ها و اختلالات ژنتیکی
6- تعیین جنسیت و آزمایشات غربال گری
7- دامپروری و کشاورزی (تولید محصولات نوترکیب)
8- داروسازی( تولید هورمون های مصنوعی)
9- استفاده در آزمایشگاه های میکروبیولوژی مواد غذایی
10-  شناخت عوامل بیماری زایی و پرتو زایی و ویروس ها در مواد غذایی

کاربرد در مواد غذایی

راه های تشخیص آلودگی میکروبی در آزمایشگاه های صنایع غذایی مانند شمارش ساده (Plate count)، وقت گیر است و دقت کمتری دارد در حالی که PCR یک روش سریع و دقیق در تشخیص باکتری های مشکوک در مواد غذایی می باشد، از  PCRدر تشخیص آلودگی باکتری سالمونلا اینتریتیدیس در محصولات ماکیان استفاده شده است .