الکتروفورز

الکتروفورز

الکتروفورز فرایند حرکت ملکول ها ی باردار در میدان الکتریکی است ، در این فرایند خصوصیات فیزیکوشیمیایی ملکول ها همچون میزان بار، اندازه، شکل و شرایط محیط اطراف آن ها از قبیل نوع و غلظت محیط نگهدارنده، جنس، قدرت یونی و PH بافر ، درجه حرارت و مولفه های میدان الکتریکی ( ولتاژ، شدت جریان و زمان الکتروفورز) موثر هستند.

کاربرد الکتروفورز

الکتروفورز امروزه در رشته های بیولوژی ،بیوشیمی، شیمی پروتئین، داروشناسی، پزشکی قانونی، تشخیص طبی، علوم دامی، کنترل مواد غذایی، بیولوژی ملکولی و ژنتیک کاربرد  دارد.

انواع روش های الکتروفورز

1- الکتروفورز ناحیه ای(Zone electrophoresis)
2- ایزوتکوفورز( Isotachophoresis)
3- ایزوالکتریک  فوکوسینگ( Isoelectric focusing)

الکتروفورز ناحیه ای:  در این روش سیستم بافری پیوسته ای در سراسر مسیر الکتروفورز وجود دارد به همین دلیل PH در طول آزمایش ثابت باقی می ماند، این روش را می توان در محیط های مایع یا نیمه جامد (ژل آگارز یا پلی آکریل آمید) انجام داد.

ایزوتکوفورز: در این روش جداسازی پرونئین ها در سیستم بافری ناپیوسته صورت می گیرد، در این سیستم برخلاف سیستم بافری پیوسته، برای آماده سازی نمونه جهت الکتروفورز، تهیه ژل و بافر موجود در مخازن تانک الکتروفورز از بافرهایی با ترکیب یونی و PHهای مختلف استفاده می شود.

ایزوالکتریک فوکوسینگ: در این روش جداسازی مواد در یک شیب PH صورت می گیرد به همین دلیل برای جدا کردن مواد آمفوتری مثل پروتئین ها و پپتیدها به کار می رود و هر ملکول آمفوتری به طرف یکی از قطب ها تا رسیدن به PH معادل نقطه ایزوالکتریک خود حرکت می کند و در آن جا از حرکت باز می ایستد ، این روش برای بررسی کیفی ، بررسی خلوص پروتئین و تهیه پروتئین خالص به کار می رود.

اجزای لازم برای انجام الکتروفورز

1- منبع تغذیه (Power Supply) :تامین کننده جریان برق مستقیم مورد نیاز الکتروفورز در ولتاژهای مختلف است.
2- بافر(Buffer) : نقش بافر تامین محیطی یونی با PH ثابت برای انتقال جریان الکتریکی  در طول مدت الکتروفورز می باشد. یون های بافر، الکترون های جریان الکتریی را حمل را حمل کرده و PH محیط را در طول مدت الکتروفورز ثابت نگه می دارند، برای الکتروفورز مواد مختلف بافر های گوناگون با PH مختلف به کار می رود مانند بافر سیترات  با PH  اسیدی برای الکتروفورز هموگلوبین در ژل سیترات آگار و یا بافر باربیتال با PH  قلیایی برای الکتروفورز پروتئین های سرم در استات سلولز.
3- محیط پایه( Supporting media) : وظیفه اصلی محیط پایه فراهم نمودن محیطی مناسب برای انتقال یون ها و تفکیک اجزاء مختلف نمونه از یکدیگر می باشد، بنابراین ضمن توانایی جذب و نگهداری مایع الکترولیت ، دارای منافذ مناسبی جهت عبور ماکروملکول مورد نظر نیز  می باشد .
4- تانک الکتروفورز( Tank  Electrophresis) : تانک های الکتروفورز  عایق جریان الکتریسیته بوده و در بیشتر مواقع از جنس پلاستیک ساخته می شوند، مخزنی برای نگهداری بافر در طول مدت الکتروفورز داشته و همچنین دارای مکانی برای تعبیه الکترودهای کاتد و آند می باشد.

انواع محیط پایه

پلی اکریل آمید و آگارز متداول ترین محیط های نیمه جامد برای الکتروفورز پروتئین ها هستند، ساختمان اسفنج مانند این دو ژل به نحوی است که می توانند پروتئین ها و اسید های نوکلئیک  با اندازه متفاوت را غربال کنند. منافذ ژل پلی اکریل آمید کوچکتر از منافذ ژل آگارز است . نشاسته از دیگر محیط های الکتروفورز است که در موارد خاصی مثل جداسازی ایزو آنزیم ها مناسب تر از سایر محیط های الکتروفورز است . غشاهای استات سلولز منافذ بزرگی دارد و تقریبا می توان گفت اثر غربالگری روی پروتئین ها ندارد و جداسازی الکتروفورتیک در این روش بر اساس میزان بار ملکول ها انجام می گیرد و نقل و انتقال آن بسیار آسان بوده و با استفاده از آن اعمال جداسازی و رنگ آمیزی سریع تر از محیط های دیگر انجام می شود.

عوامل تاثیر گذار در الکتروفورز ( پروتئین ها)

1-  نقش پروتئین ها: پروتئین ها ماکروملکول هایی هستند که بسته به PH محیط می توانند دارای بار مثبت، منفی یا خنثی باشند. بار هر پروتئین به دلیل یونیزه شدن گروه های آمین (NH+ᴈ) و کربوکسیل (COOˉ) در ابتدا و انتهای ملکول و اسید های آمینه بازی یا اسیدی تشکیل دهنده ساختمان آن می باشد. میزان یونیزه شدن این گروه های  قابل یونیزاسیون ، متاثر از غلظت یون هیدروژن (PH ) محیط اطراف پروتئین است. با توجه به تاثیر PH محیط در میزان یونیزه شدن  گروه های اسید و بازی ، هر پروتئین دارای یک نقطه ایزوالکتریک (PI) منحصر به فرد خود است، نقطه ایزوالکتریک PH ای است که در آن تعداد بار های مثبت و منفی موجود در ساختمان پروتئین با هم برابر و بار خالص ملکول صفر است اگر پروتئین در PH پایین تر از PI خود قرار گیرد بار مثبت پیدا کرده ، به عنوان کاتیون (یون مثبت) عمل می کند و در میدان الکتریکی به طرف کاتد (قطب منفی) حرکت می نماید  و در حالتی که پروتئین در PH  بالاتر از PI خود قرار گیرد بار منفی پیدا کرده و به عنوان آنیون به طرف آند می رود. PI اغلب پروتئین ها در دامنه 7-4 قرار دارد .بنابراین اگر در محیط دارای PH بازی تحت تاثیر میدان الکتریکی قرار گیرند  به طرف قطب مثبت حرکت می کنند سرعت حرکت پروتئین ها در این حالت ( حرکت آزادانه در محیط مایع  یا در استات سلولز که دارای منافذ بزرگی است ) عمدتا وابسته به میزان بار منفی آن ها است در حالتی که الکتروفورز در محیط های نگهدارنده ای چون آگارز یا پلی اکریل آمید صورت می گیرد، شکل و اندازه پروتئین از دیگر عوامل مهمی است که میزان حرکت ملکول را تحت تاثیر قرار می دهد .

2- نقش بافر: نوع بافر و خصوصیات آن مانند قدرت یونی، ظرفیت بافری و PH  از عوامل بسیار اساسی هر الکتروفورز محسوب می شوند، قدرت یونی بافر باید تا حد امکان پایین بوده به طوریکه  سهم ملکول های  باردار نمونه در برقراری جریان به اندازه کافی بزرگ باشد. پروتئین ها ممکن است به بعضی PHها  یا انواع خاصی از بافر ها حساس باشند و دچار تغییراتی در ساختمان سه بعدی، دناتوراسیون، پلیمر شدن یا سایر واکنش های بین ملکولی شوند که در الکتروفورز حائز اهمیت است.

3- مولفه های میدان الکتریکی: در الکتروفورز نیروی اصلی حرکت دهنده ملکول های باردار، اختلاف پتانسیل  می باشد و سرعت حرکت ملکول ها حاصل ولتاژ میدان الکتریکی و شارژ ملکول ها است. میدان الکتریکی با حرکت دادن بافر سبب تولید جریان پتانسیل می شود و بزرگی شدت جریان  به قدرت یونی بافر بستگی دارد .